Триходерма гриб

Триходерма – верный, а главное, экологически безвредный союзник в борьбе с фитофторозом и многочисленными грибковыми заболеваниями. Но покупать ее для полноценного лечения сада нужно очень много, а это по карману не каждому.

Решить эту задачу и обзавестись собственной проверенной триходермой сумела наша читательница из Нижнего Новгорода. С помощью полезных грибков она не только избавилась от фитофторы в своем саду и огороде, но и в целом оздоровила землю на участке.

Анастасия Ермакова – опытный садовод-огородник из Нижнего Новгорода. Она сумела избавиться от фитофторы на участке без «химии» и продолжает свои эксперименты.

Зачем выращивать триходерму самому

Для начала разберемся, почему выращивать триходерму дома не просто можно, но и нужно.

Экономическая выгода

Не просто выгода, а существенная экономия бюджета! Давайте посчитаем: 15 г препарата Триходермин стоит на данный момент около 50 рублей. Это количество разводится в 5 л воды, т.е. даже если проливать очень экономно, только лунки при посадке, этого количества хватит на 10 растений. Подумайте, посчитайте, сколько кустов томатов, перцев, огурцов, баклажанов вы высаживаете? А ведь все эти культуры очень подвержены различным гнилям и другим заболеваниям, и для них триходерма в качестве биологической защиты просто незаменима.

Скажу про себя – у меня этих культур в двух теплицах высаживается около 120 корней. Нетрудно посчитать, что только при высадке мне нужно будет потратить на промышленные препараты триходермы около 600 рублей. А ведь нужно еще в течение сезона подселять в почву триходерму и регулярно опрыскивать растения от болезней.

А теперь рассчитаем, сколько будет стоить домашнее размножение триходермы. Промышленный препарат понадобится только в самый первый раз и в очень небольших количествах, но пусть будет 50 рублей. Еще купим 1 кг перловой крупы, самой простой по 25 рублей. Из этого количества ингредиентов мы получим объем препарата, рассчитанный на 150 л рабочего раствора. Дальше понадобится только крупа. Почувствуйте разницу!

Уверенность в качестве

Размножая препарат дома, вы будете уверены, что заселяете почву живым грибком, а не поливаете или опрыскиваете обычной водой. По крайней мере, из одного из промышленных препаратов мне (и не только мне) ничего вырастить не удалось, живых спор он не содержал.

Активная стадия препарата

Приготавливая раствор из промышленного препарата, мы получаем взвесь с живыми спорами грибка, которым, чтобы вступить в активную фазу, еще нужно прорасти. Домашний препарат содержит уже проросший грибок и споры и начинает действовать сразу.

Всегда под рукой

Готовый препарат в любых количествах всегда будет под рукой, что очень удобно.

Не нужно экономить. Не нужно выбирать, какие растения и грядки обработать, а какие подождут или обойдутся. Вы с легкостью и почти без затрат сможете пролить все свои грядки без исключения, а также регулярно опрыскивать растения этим мощным биологическим фунгицидом от болезней.

Как размножить триходерму в домашних условиях

Инструкция по выращиванию триходермы довольно проста, и реализовать ее способен даже начинающий дачник.

  1. Перловую крупу хорошо промойте, пока вода не станет прозрачной.
  2. Замочите в холодной воде на 8-12 часов (я ставлю на ночь).
  3. Слейте воду (дайте ей хорошо стечь). Хорошо, если немного промокнете полотенцем.
  4. Банку простерилизуйте любым способом, какой вам больше нравится.
  5. Засыпьте зерно в банку и поставьте ее в микроволновку на 4-7 минут (зависит от мощности) для пропаривания. Зерно должно хорошо нагреться, но не приготовиться!
  6. В остывшее зерно налейте разведенный по инструкции промышленный препарат триходермы. На пол-литровую банку надо примерно 2 ст.л.
  7. Закройте банку не герметично. Несколько слоев туалетной бумаги или марли, тетрадный листок под резинку.
  8. Поставьте в теплое место.

Все! Через 1-2 дня вы увидите на зернах белый пушок – это мицелий, еще через 2-3 дня уже будет видно спороношение – ярко-зеленые или ярко-желтые очаги. Постепенно они будут разрастаться и покроют весь мицелий. На этом этапе препарат готов.

Если вы все сделали по инструкции, но через двое суток так и не увидели белый пушок мицелия, значит, промышленный препарат, который вы использовали, не содержал живых спор – это фальсификат, нарушение технологии производства или прямой обман производителя. Ждать дольше двух дней не имеет смысла, т.к. споры (если они там есть) при благоприятных условиях прорастают очень быстро.

Как использовать домашнюю триходерму

2/3 стакана зерна размешайте в ведре воды и оставьте на 3-4 часа (можно на ночь). Опять хорошо вымешайте. Если будете поливать ковшом или лейкой без насадки, можно лить прямо из ведра. Для опрыскивания из лейки с насадкой раствор нужно процедить. Оставшиеся зерна прикопайте под дерево или кустарник – там еще достаточно триходермы.

В 1 кг перловой крупы – это примерно 5 стаканов. А 1 стакан замоченной крупы по объему будет равен примерно 0,5 л. 0,5 л готового препарата разводят в 30 л воды.

Неиспользованный препарат можно хранить в замороженном или хорошо просушенном виде сколь угодно долго.

Поблагодарить Анастасию за интересную информацию или задать уточняющие вопросы можно на ее странице в Facebook.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности и в сельском хозяйстве. Мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие бета-глюканолитические, целлюлозо-, гемицеллюлозолитические и пектолитические ферменты, лизирующие клеточную стенку, как и отдельные карбогидразы, могут применяться для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве. Известно достаточно много штаммов — продуцентов отдельных карбогидраз, главным образом целлюлаз, и способы их культивирования в аэробных условиях. Как правило, микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Обычно комплекс включает преимущественно целлюлазы, а также другие карбогидразы, среди которых чаще всего встречаются ксиланазы и пектиназы. Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить достаточно высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемого субстрата, а также стоимостью самих субстратов. Известны штаммы Aspergillus niger, при культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ 2057179, кл. C 12 N 9/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно: целлюлаза — 5,0 Е/мл; ксиланаза — 125,0 Е/мл; бета-глюкозидаза — 20,0 Е/мл; бета-ксилозидаза — 36,0 Е/мл; бета-глюканаза — 0,95 Е/мл и ламинариназа — 1,25 Е/мл. Хотя грибы рода Aspergillus образуют комплексы с широким спектром карбогидраз, однако активность большинства отдельных компонентов комплекса недостаточно высокая, что часто делает нецелесообразным их практическое применение. Как известно, наиболее активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma. С целью повышения их способности к продукции и адаптации к более дешевым средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы Trichoderma longibrachiatum (syn. Trichoderma reesei). Мутант Trichoderma.reesei MCG 80 при непрерывном культивировании на питательной среде с 8% целлюлозы и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл FPA (Патент США 4472504, кл. C 12 N 9/42, 1984 г.). FPA — активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (Т.К.Chose., Pure and Appl. Chem., vol.59, 2, pp.257-268). Известен мутант Trichoderma.reesei IMET 43803, который вследствие частичного уменьшения катаболитной репрессии биосинтеза обеспечивает высокую продуктивность целлюлаз и высокий (до 10 ед/мл FPA) уровень активности целлюлазы при культивировании на среде с лактозой (патент ГДР 291673, кл. C 12 N 9/42, 1991 г.). Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Trichoderma.reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28), полученный с помощью парасексуальных процессов из исходной культуры Trichoderma reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ 2001949, C 12 N 9/42, 1993 г. ). Штамм 18.2/КК имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой — 18.2 ед/мл (81ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке -12-14 ед/мл (100-110 ч). Однако, как следует из имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в результате научных исследований, грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью, преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени — в отношении других карбогидраз (бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ), необходимых для гидролиза различных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья. Штамм Trichoderma reesei BCM 18.2/КК (ВГНКИ-28) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema, а именно он имеет низкую продуктивность по карбогидразам, не являющимися целлюлазами (бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы). Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов — продуцента мультиферментного комплекса, содержащего широкий спектр карбогидраз и пригодного для культивирования на дешевом сырье в присутствии высоких концентраций сахаров. Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности как целлюлаз, так и других компонентов комплекса — бета-глюканаз, ксиланаз и пектиназ в ферментационной среде, а также в повышении способности к продукции маннаназы. Сущность объекта изобретения — новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 — продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы. Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-1 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под ВКМ F-3634 D. Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Trichoderma reesei QM 6a (ВКМ F-2047). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28oС в течение 2 сут и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше. Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4oС с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев. Культурально-морфологические признаки штамма

При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80-90 мм на 7 сутки при росте при 25oС. Мицелий развит преимущественно субстратный, гиалиновый; воздушный скудный, белый. Конидиальная зона сформирована многочисленными компактными подушечками диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом — зеленого. Обратная сторона — светло-зеленовато-желтая. Конидиеносцы неокрашенные, гладкостенные, формируются преимущественно на субстратном мицелии, главные ветви длинные и прямые, иногда извитые, до 5 мм шириной у основания, постепенно сужающиеся к вершине до 2 мкм ширины; боковые ветви образуются через неравные интервалы, обычно короткие, формируются под углом к вершине конидиеносцев. Фиалиды одиночные, булавовидные или широко бутыловидные, часто искривленные, размер — 5-10 ч 2-3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидальные, 4-7 ч 2,5-4 мкм, собраны в небольшие головки на вершинах фиалид. При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,3 ч-1, в конце культивирования — 0,1 ч-1. Физиолого-биохимические признаки штамма
Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32oС (29-34oС), оптимум для образования целлюлаз 28oС (26-29oС). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз. Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается. Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу. Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамии, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу. Использует аммонийный и органический азот, очень плохо ассимилирует нитратную форму азота. Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, пектине, галактоманнане и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей. Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки — 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 сут при 30oС и затем 20 ч при 45oС. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита). Полученный мутант Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Trichoderma reesei QM 6а существенно сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (светло-зеленовато-желтые) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлазы, карбогидраз — бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ. Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения». Культивирование штамма Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов — источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов — карбогидраз (целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом — гидролизатом крахмала. Активность целлюлаз определяют по FPA (согласно рекомендации UРАС), активность бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять бета-глюкан, ксилан, полигалактуроновую кислоту и галактоманнан соответственно. За единицу активности принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50oС и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В. Гусаков, И. М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156). Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с помощью улътрафильтрации или в виде сухих препаратов. Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними. Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3634D выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29oС в течение 7 сут и далее при комнатной температуре на свету в течение 5 сут. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом — 40,0; солодовые ростки — 14,0; (NH4)2SO4 — 6,0; КН2РО4 — 2,0; MgSО47H2О — 0,6; рН 5,4. Колбы инкубируют на качалке при 30oС и 200 об/мин в течение 120 ч. Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 6,5; 25,0; 20,0; 7,0 и 0,5 ед/мл соответственно. Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) — 4,0; лактоза — 20,0; (NH4)2SО4 — 6,0; KН2PО4 — 2.0; MgSО47H2О — 0,6; рН 5,4. Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 6,0; 30,2; 22,0; 7,5 и 1,2 ед/мл, соответственно. Пример 3. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (как описано в примере 1). Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24 ч при 32oС на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: МКЦ — 4,0; лактоза — 20,0; (NH4)2SО4 — 6,0; КН2РО4 — 2,0; MgSО47H2О — 0,6. Через 24 ч начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28oС, а рН — 4,2. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л. Активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляют на 110-120 ч культивирования 20,0; 380,0; 65,0; 23,0 и 24,0 ед/мл соответственно. Пример 4. Процесс проводят в ферментере типа АНКУМ 2М. Режим ферментации тот же, что в примере 3. Культивирование осуществляют на среде состава, приведенного в примере 3, но вместо лактозы на первой фазе культивирования в составе жидкой питательной среды используют ферментативный гидролизат крахмала (600 мл на 6,5 л ферментере, начальная концентрация глюкозы в среде 2,9-3,3%), а вместо МКЦ — пшеничные отруби в концентрации 40 г/л. На второй фазе культивирования добавляют лактозу так же, как в примере 3. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования. Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 21,0; 470,0; 90,0; 35,0 и 30,0 ед/мл соответственно. Пример 5. Процесс проводят в ферментере типа АНКУМ 2М. Режим ферментации тот же, что в примере 3. Культивирование осуществляют на среде состава, приведенного в примере 4, но кроме пшеничных отрубей и гидролизата крахмала в составе жидкой питательно среды на первой фазе культивирования используют также МКЦ в концентрации 5 г/л. На второй фазе культивирования добавляют лактозу так же, как в примере 3. В процессе ферментации через 40 и 84 ч после ее начала в среду вносят МКЦ в количестве, чтобы ее концентрация была 2 г/л ферментационной среды, а через 60 ч — минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале первой фазы процесса культивирования. Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 25,0; 510,0; 108,0; 40,0 и 35,0 ед/мл соответственно. Таким образом, предлагаемый штамм Trichoderma longibrachiatum ВКМ F-3634D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, бета-глюканазы и маннаназы, что создает возможность получения полного комплекса ферментов, а также при необходимости отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов. Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и особенно в качестве кормовых добавок.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum ВКМ F-3634 D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН) — продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.

Триходерма вериде — грибки-антагонисты, помогающие дачникам и огородникам бороться с грибковыми болезнями растений: фитофторозом, альтернариозом, фузариозом, мучнистой росой и др. В отличие от фунгицидов, грибки рода триходерма угнетают болезнетворные грибки естественным образом, паразитируя на них. Другими словами, триходерма вериде естественный, природный враг многих видов грибков.

За последние годы сельскохозяйственная химия продвинулась далеко вперед, но и грибки мутируют не в лучшую сторону, ведь известно, что не убивает, то делает сильнее. Фитофтора, не добитая в этом году фунгицидами, окрепнет и к следующему сезону станет более устойчивой, а через 10 лет будет радоваться фунгицидам как десерту.

Что же делать? Может стоит опустить руки и покупать овощи и фрукты в магазинах? Полагаю, что отчаиваться рано, надо задействовать недостающие резервы в природе. Да, бороться надо используя натуральные средства, которые удерживают гнилостные грибки в природном равновесии и не дают им разгуляться.

Дело в том, что в природе все сбалансировано, а на дачном участке природного баланса нет и в помине — земля у нас окультурена, сорняки выполоты, насекомые отравлены, поэтому грибкам никто не противостоит. Кто же противостоит гнилостным грибам в природе? Конечно же другие грибы — грибы-антагонисты. По сути, грибы-антагонисты — это хищники из мира грибов, пожирающие и паразитирующие на других грибках.

Триходерма — биофунгицид, уничтожающий грибки

Кандидоспоры грибка Триходерма вериде, увеличенные в 16 раз. Trichoderma viride conidiophores magnified 16X. Identified using Barnett, H. L. & Hunter, B. B. (1998) Illustrated Genera of Imperfect Fungi. APS Press: St. Paul, MN; pp. 132–3 ISBN 0-89054-192-2. Recovered from white onion (Allium cepa L.). Host status confirmed using Farr, D. F., Bills, G. F., Chamuris, G. P., & Rossman, A. Y. (1995) Fungi on Plants and Plant Products in the United States. APS Press: St. Paul, MN; pp. 272–4 ISBN 0-89054-099-3. Фото: wikipedia.org

Триходерма — род грибков-антагонистов (сапрофитов), которые живут в природе повсеместно, а вот в огороде их надо поселять сознательно, купив мицелий или споры в магазине. Наиболее распространенным препаратом, продающимся в каждом магазине, является Триходерма Вериде, но Триходерма вериде (лат. Trichoderma viride) лишь представитель рода, кроме нее на помощь могут прийти Trichoderma lignorum, Trichoderma koningii, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningi, Trichoderma pilulifermum, Trichoderma polysporum, Trichoderma hamatum, Trichoderma aureoviride.

Правда другие виды грибков-сапрофитов из рода Триходерма используются в других сферах, например, Trichoderma polysporum, вырабатывающий ингибитор кальцинейрина, Циклоспорин A (CsA), является иммунодепрессантом, предписанным для трансплантации органов, для предотвращения отторжения, поэтому с успехом используется в медицине.

Trichoderma reesei используется для производства целлюлазы и гемицеллюлозы, Trichoderma longibrachiatum используется для производства ксиланазы, а Trichoderma harzianum используется для производства хитиназы.

Вся эта сапрофитная братия населяет почвы лесов, полей, лугов, перерабатывая органические остатки, преобразуя гниющие останки животных и растений в полезные для почвы вещества. По сути, триходерма — мельчайший гриб, паразитирующий на болезнетворных грибках. Триходерма напоминает плесень на почве.

Враг нашего врага — наш друг. Надо срочно принимать в садово-огородный штат ценного специалиста по борьбе с гнилями, ведь сапрофиты рода Триходермы приносят огромную пользу, судите сами:

  • грибки обволакивают частицы почвы мицелием, создавая плодородную структуру;
  • грибки рода триходерма участвуют в синтезе природных антибиотиков — триходермина и виридина;
  • грибки-сапрофиты усиливают питание растений, благодаря симбиозу с корневой системой, формируют микоризу;
  • почвенные грибки-сапрофиты вырабатывают гумус;
  • сапрофиты синтезируют биологически активные вещества, которые угнетают возбудителей болезней, попутно укрепляют иммунитет здоровых растений;
  • триходерма обогащает земли сада и огорода питательными веществами, питаясь гниющей органикой;
  • триходерма паразитирует на телах и мицелии грибков-патогенов, уничтожая фитофтору, вертициллез, плодовые гнили, корневые гнили, паршу, мучнистую росу и др.;
  • триходермы некоторых видов могут вырабатывать фитогормоны, типа: ауксин, этилен, цитокинин; стимулирующие развитие растений.

Всё что делают сапрофиты не манна небесная для огородника, а природная сущность этих организмов. Да, вся польза этих грибов заключается в том, чтобы они просто поселились на вашем участке.

От каких болезней поможет триходерма вериде

Триходерма поможет от фитофтороза и других грибковых заболеваний растений. Фото: Hippocampus Bildarchiv

Триходерму вериде и аналоги на основе грибков рода триходерма помогут избавить растений на вашей даче от грибковых болезней. Триходерма уничтожает:

  • альтернариоз;
  • вертицеллезное увядание;
  • корневую и плодовую гниль;
  • ризоктониоз;
  • трахеомикоз;
  • фитофтороз;
  • фузариоз;
  • черную ножку.

Не стоит ждать, пока на вашем участке почвенные грибы разрастутся до лесных масштабов — в лесу сапрофиты живут на одном месте из года в год, почву никто не перекапывает, а о химикатах они не слышали и подавно. Сложно противодействовать патогенным грибкам, если тебя все время изводят.

Поэтому чтобы использовать все преимущества грибков-сапрофитов придумали выпускать и продавать населению и организациям препараты, содержащие споры и мицелий грибков рода Триходерма. Чаще и проще всего купить препарат Триходерма вериде, содержащий миллиарды спор одноименного грибка.

Споры грибка Триходерма вериде можно купить в магазине, в виде одноименного препарата

Триходерма вериде это кристаллический порошок, который растворяется в теплой воде. Обычно на 10 литров воды требуется 30 грамм препарата. Раствор препарата надо использовать в течение дня, поливая растения под корень по 150-200 мл во влажную почву. Также рабочим раствором можно опрыскивать листья растений, для предотвращения гнилей.

Чаще всего препараты на основе грибка Триходерма верде и других грибков рода Триходерма используется для:

  • предпосевной обработки (замачивания и опрыскивания) семян картофеля, огурцов, томатов, баклажанов, перцев;
  • полива капустных растений под корень, для защиты капусты от болезней;
  • обработки рассады всех видов растений перед высадкой, включая корневую систему;
  • опрыскивания органических удобрений перед заделкой в почву при перекапывании;
  • дезинфекции грунта в теплице весной и осенью;
  • полива лунок и рядков перед посадкой картофеля;
  • профилактики и лечения грибковых болезней у комнатных растений.

Умело применяя препараты на основе грибков рода Триходерма вы сможете победить грибковые болезни растений в зародыше, используя естественных врагов, без применения химии.

Читать про: триходерма , триходерма вериде , грибковые болезни , фитофтороз , ризоктониоз , альтернариоз , защита от гнили , защита от грибков Грибы  Болезни растений  Класс! Отправить Отправить

Триходерма: история и особенности названия

Впервые триходерма была описана в 1794 году всемирноизвестным ученым, «отцом микологии» Кристианом Хедериком Персуном. Долгое время считалось, что род триходермы состоит всего из одного вида, однако в наше время идентифицировано около 88 видов этого грибка.

Латинское название грибка имеет древнегреческий корни, и переводиться как «волосяной покров». Такое название грибок получил из-за характерного тонкого, длинного мицелия, который действительно похож на пучок волос.

Триходерма: естественная среда обитания

Триходерма встречается практически повсеместно в лесных и сельскохозяйственных почвах на всех широтах без исключения. А это значит, что этот гриб является одним из основных элементов почвы, без которого нельзя вырастить ни одно растение. Кроме того, триходерма может расти на коре поваленных деревьев, а также на других грибах.

Триходерма: интересные факты

Как мы уже успели выяснить, триходерма – это полезный гриб, который живет в почве и обогащает его полезными, неорганическими веществами. Однако мало кто знает, что этот грибок также может паразитировать на других грибах, которые содержаться в почве, таких как Фузариум или Фитофтора. Таким образом, в процессе своей жизни триходерма не только перерабатывает органические отходы, но и очищает почву от фитопатогенных грибков.

Что примечательно, этот гриб никогда не паразитирует на растениях. Скорее наоборот – он создает с их корнями симбиотические связи, которые значительно улучшают питание растения и его стойкость к различным заболеваниям.

Триходерма: применение

Так как триходерма является очень полезным компонентом почвы, то совсем не удивительно, что её широко используют в сельском хозяйстве для борьбы с различными заболеваниями растений. Из спор и мицелия этого грибка изготовляют биофунгицидный препарат «Триходермин», который не только эффективно борется с фитопатогенной флорой, но и считается абсолютно безопасным средством, не влияющим на состояние человеческого организма.

А это значит, что обработанные этим препаратом растения можно употреблять в пищу практически сразу после обработки.

Том 155, кн. 2

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Естественные науки

УДК 577.152.3

КСИЛАНАЗЫ Тпекойегти гееяе1 — БИОСИНТЕЗ

И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ЗЕРНОВЫХ КОРМОВ

Ю.А. Морозова, Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова Аннотация

Штамм Тпскоёегша гее^ег М18.2 способен к активному синтезу ксиланаз и целлю-лаз на отходе спиртового производства — послеспиртовой барде. При глубинном культивировании на барде активность ксиланаз и целлюлаз достигала максимального значения на четвёртые сутки культивирования и составляла 530 и 3.3 МЕ/мл соответственно. Исследован состав углеводной фракции фуражных сортов зерновых культур Республики Татарстан. Содержание ксиланов в ней достигало 11.4%. Глубина ферментативного гидролиза зернового сырья исследуемыми гидролитическими ферментами Тпскоёвгша гвв^’в! M18.2 и коммерческим препаратом амилаз «Термамил» достигала 43% абсолютно сухого веса при 60 °С.

Ключевые слова: Тпскоёвгша гее^ег, ксиланазы, целлюлазы, амилазы, ферментативный гидролиз.

Введение

Одними из наиболее изучаемых микроорганизмов во всём мире считаются грибы рода Тпскоёетша . Они являются продуцентами комплекса гидролитических ферментов — эндо-1,4-Р-ксиланаз (КФ 3.2.1.8), целлюлаз (КФ 3.2.1.4), эндо-1,3(4)-Р-глюканаз (КФ 3.2.1.6) — и обладают высокой секреторной способностью. Указанные свойства делают ферментные препараты на основе штаммов Тпскоёетша универсальными для применения во многих биотехнологических процессах. Интерес к этим ферментам растет благодаря огромному потенциалу их использования в сельскохозяйственном производстве и ряде отраслей промышленности, ориентированных на переработку растительного сырья .

В настоящее время для культивирования штаммов Тпскоёетша, синтезирующих ксиланазы и целлюлазы, как правило, используют среды, полученные путем экстрагирования отходов переработки зерна злаков и растворы ксилана . Приготовление таких сред требует временных и финансовых затрат.

Микроорганизмы, в том числе микроскопические грибы, обладают высокой адаптивностью к изменению внешних факторов — источников питания и условий роста, что обусловлено гибкой регуляцией обменных процессов, включая синтез ферментов. Реализация способности к сверхсинтезу, то есть образованию определённого продукта в количествах, превосходящих физиологические потребности микроорганизма, зависит прежде всего от факторов питания, компонентов питательной среды, содержащих индуцирующие ксиланазы и целлюлазы вещества . Однако до настоящего времени нет исследований, однозначно определивших оптимальный состав среды для синтеза ксиланаз грибом Тпскоёетша.

Разные группы исследователей культивируют продуцент на разных средах . В связи с этим продолжают быть актуальными исследования, направленные на поиск новых эффективных сред для биосинтеза ксиланаз грибом Тпекоёегта.

Между тем при производстве спирта из зерна (например, пшеницы, кукурузы или ржи) получается довольно большое количество отработанной массы прошедшего ферментацию зернового сырья, из которого путем дистилляции извлечен алкоголь. Эта масса называется послеспиртовой бардой . Зерновая барда, получаемая на спиртовых заводах, содержит различные питательные компоненты и является потенциально пригодной средой для культивирования штаммов различных грибов.

Ферменты грибов рода Тпекоёегта могут иметь практическое значение при применении в кормах сельскохозяйственных животных, содержащих рожь и ячмень. Так, в составе ржи негативную роль играют пентозаны. Они снижают переваримость ржаного корма и, как следствие, прирост животных. У цыплят и поросят, наиболее чувствительных групп животных, водорастворимые фракции углеводов набухают в пищеварительном тракте, замедляют скорость прохождения химуса, приводят к усиленному брожению. Высоковязкие слизи затрудняют воздействие амилолитических ферментов. При скармливании ржи птице выделяется жидкий, липкий помет, что приводит к обезвоживанию организма и в результате к потере живой массы вместо прироста . Одним из важнейших биохимических компонентов зерна ячменя являются также Р-глюканы, или растворимая клетчатка . Высокое содержание Р-глюканов в зерне ячменя негативно влияет на его применение в кормах — увеличивает вязкость химуса и снижает его переваримость. Ксиланазы и целлюлазы грибов рода Тпекоёегта в составе зерновых кормосмесей осуществляют гидролиз антипитательных полимеров и позволяют снизить их негативное влияние, что имеет большое практическое значение.

Цель настоящей работы — установление закономерностей биосинтеза ксиланаз и целлюлаз грибами рода Тпекоёегта на послеспиртовой барде и исследование эффективности использования этого ферментного комплекса в процессе гидролиза различных зерновых смесей.

Материалы и методы

Исследуемые микроорганизмы. В работе использовали микроскопический гриб Тпекоёегта reesei М18.2, предоставленный лабораторией Саксонского института прикладной биотехнологии (г. Лейпциг, Германия), полученный путём селекции штаммов, подвергнутых воздействию мутагенных факторов.

Среды, для культивирования микроорганизмов.

Картофельно-глюкозный агар (КГА). Состав КГА (г/л): отвар картофеля -200, агар — 20, глюкоза — 20, стрептомицин — 1.

Послеспиртовая барда. Была предоставлена Усадским спиртовым заводом Республики Татарстан (табл. 1).

КСИЛАНАЗЫ Trichoderma reesei — БИОСИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ.

Табл. 1

Биохимический состав барды

Результаты анализа сушеной

барды, пшеничной

Массовая доля, %

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

влаги 7.90

протеина 30.20

клетчатки 5.10

жира 9.45

золы 6.23

крахмала 1.25

растворимых сахаров 3.27

кальция 0.07

фосфора 1.05

Токсичность не установлено

Витамины, тыс. МЕ/кг

А 4.50

Б —

Е 18.8

Витамины группы В, мг/кг

В1 7.30

В2 34

В4 170

В5 72

Зерновые смеси. В работе использовались фуражные сорта, выращенные на территории Республики Татарстан (РТ).

Культивирование. Культивирование T. reesei M18.2 проводили на осаждённой (4000 об/мин) центрифуге Eppendorf 5810R (Германия) и нецентрифу-гированной барде глубинным способом в колбах ёмкостью 250 мл с объёмом питательной среды 50 мл при начальном рН 5.0-6.5. Стерилизацию осуществляли на автоклаве ГК-100 (г. Тюмень, Россия) при 120 °С 30 мин. Культуры грибов для инокуляции выращивали на скошенном КГА в пробирках объёмом 20 мл в течение 5 сут при температуре 28 °С. Для получения инокулята делали смыв со скошенного КГА 8 мл стерильной воды. В каждую колбу добавляли инокулят из расчета 25 мл на литр барды. Культивирование осуществлялось при 30 °С, 130 об/мин в темноте на шейкере-инкубаторе Innova 43R (США). Отбор проб проводили каждые 24 ч. Длительность культивирования составляла 7 сут.

Определение ферментативных активностей. Ксиланазную активность определяли по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) при гидролизе ксилана . За единицу активности ксиланаз принимали такое

количество фермента, которое необходимо для образования 1 мкмоль ВС за 1 мин при действии на ксилан при 50 °С на водяной бане LOIP LB-200 (Россия) и рН 5.0.

Целлюлазную активность измеряли по стандартной методике IUPAC , субстратом служила хроматографическая бумага Whatman № 1.

Амилазную активность определяли по начальной скорости образования ВС при гидролизе растворимого крахмала методом . За единицу активности амилаз принимали такое количество фермента, которое необходимо для образования 1 мкмоль ВС за 1 мин при действии на субстрат при 50 °С и рН 5.

Анализ концентрации ВС проводили по стандартной методике с помощью окрашивания их динитросалициловой кислотой .

Гидролиз зерновых смесей исследуемыми ферментными препаратами. Инкубацию зерновой смеси с исследуемой культуральной жидкостью, содержащей ксиланазы и целлюлазы, проводили в стеклянных колбах на водяной бане LOIP LB-200 в течение 60 мин при 60 °С. Гидромодуль в опыте составлял 1 : 3. Гидролизованную суспензию разделяли центрифугированием при 4000 об./мин 10 мин. Содержание растворенных веществ определяли с использованием рефрактометра.

Определение углеводного состава зерна и зерновых гидролизатов. Исследования углеводного состава зерна проведены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, после проведения мягкого кислотного гидролиза .

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Статистическая обработка результатов. Для сравнения применяли интервальные оценки. Уровень значимости р < 0.05. Данные на рисунках и в таблицах представлены как среднее ± стандартное отклонение .

Результаты и их обсуждение

В работе описаны результаты синтеза гидролитических ферментов Trichoderma при культивировании на послеспиртовой барде. Барда является суспензией, содержащей взвешенные нерастворимые частицы, которые могут быть осаждены центрифугированием, и растворённые в жидкой фазе компоненты. Было проведено культивирование продуцента на осаждённой центрифугированием и неосаждённой бардах.

Динамика изменения активности ксиланаз и целлюлаз в КЖ при культивировании на двух видах барды приведена на рис. 1. Результаты исследования показали, что максимальная ксиланазная и целлюлазная активности в КЖ изолята T. reesei M18.2 были достигнуты на 4-е сутки культивирования (рис. 1, а-г). При росте продуцента на неосаждённой фракции барды ксиланазная активность составляла 335 (рис. 1, а), а целлюлазная активность 1.35 МЕ/мл (рис. 1, в). Исследования синтеза ферментов T. reesei M18.2 на осаждённой центрифугированием послеспиртовой барде показали, что максимальная активность ксиланаз и цел-люлаз в КЖ составляла 530 (рис. 1, б) и 3.3 (рис. 1, г) единиц соответственно. Сравнивая результаты экспериментов на разных видах барды, можно сделать вывод о том, что на осаждённой фракции барды происходил более активный синтез исследуемых ферментов. Ксиланазная активность становилась выше в среднем на 37%, а целлюлазная — на 40%. Предположительно, это связано с более доступными процессами диффузии растворенных веществ фильтрата барды в клетки продуцента, что обеспечивает его питательными веществами.

КСИЛАНАЗЫ Тпскоёегша гееяеI — БИОСИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ.

а)

б)

в) г)

Рис. 1. Ксиланазная (а, б) и целлюлазная (в, г) активности КЖ изолята Т. гее^е1 М18.2 на неосаждённой (а, в) и осаждённой (б, г) послеспиртовой бардах в течение 7 сут роста. Показаны средние значения трёх экспериментов и стандартные отклонения

Ранее Лариной с соавторами было показано, что максимальная ксиланазная активность КЖ Т утйе 44-11-62/3 на среде, содержащей пшеничные отруби, порошок целлюлозы, кукурузный экстракт, кормовые дрожжи, КН2Р04, (КН4)2НР04 достигала на 5-е сутки и составляла 140 ед. активности. Результаты этого же исследования показали, что самую высокую целлюлазную активность обеспечивала питательная среда в состав, которой входил свекловичный жом и кукурузная мука. Шуваева и Сысоева в своей работе по получению ксиланаз использовали среду с пшеничными отрубями, соломой и проросшими ростками зерна и показали, что активность на ней была выше на 15-20%, чем на стандартной питательной среде.

Концентрация редуцирующих сахаров в культуральной жидкости в процессе ферментации продуцента снижалась на протяжении всего процесса. В начале культивирования она составляла в среднем 6.5 г/л, к концу процесса достигала 1.1 г/л (рис. 1). Исследования показали, что в первые сутки культивирования происходил активный прирост биомассы, а начиная с 3-х суток наблюдалось резкое увеличение гидролитических активностей. Это может свидетельствовать о том, что редуцирующие сахара среды потреблялись микромицетом Т. reesei М18.2 и использовались для роста биомассы и синтеза экзоферментов.

В целом результаты показали, что послеспиртовая барда пригодна для получения ферментных препаратов из КЖ Т. reesei М18.2.

Табл. 2

Состав нецеллюлозных углеводов злаков РТ, % ВСВ

Культура Ксилоза Арабиноза Глюкоза Мальтоза Ксилан Крахмал

Рожь (фураж) 6.98 ± 0.34 5.95 ± 0.30 60.41 ± 1.25 2.07 ± 0.11 11.37 56.23

Пшеница (фураж) 5.93 ± 0.35 5.16 ± 0.25 56.62 ± 1.04 2.19 ± 0.07 6.76 52.93

Ячмень (фураж) 5.02 ± 0.21 3.62 ± 0.13 55.53 ± 0.96 1.77 ± 0.07 7.20 51.57

Применение ксиланаз в кормовой промышленности связано с необходимостью гидролиза ксилана , поэтому следующим этапом исследований стало изучение процессов гидролиза исследуемыми ферментами различных зерновых смесей, в составе которых содержался ксилан.

Для получения более полного представления о составе зерна был изучен состав углеводной фракции: было проанализировано содержание в исследуемых образцах крахмала и пентозанов. В результате проведения хроматографи-ческого исследования гидролизата получены концентрации моносахаридов ксилозы, арабинозы, глюкозы и мальтозы, входивших в состав исходного крахмала и пентозанов. Исходя из этих концентраций и молекулярных масс сахаридов, вычислено содержание этих полисахаридов в исследованных образцах зерна (табл. 2).

Из полученных результатов видно, что в составе зерна всех злаков содержится довольно значительное количество ксиланов. До 11.4% содержат фуражные сорта ржи, именно это обстоятельство не позволяет использовать ее в качестве основы кормовых рационов сельскохозяйственных животных. Несколько меньше ксиланов содержится в пшенице до 6.8% и ячмене до 7.2%.

Таким образом, проанализировав состав зерна основных районированных в РТ злаковых культур, можно сделать заключение о целесообразности исследования применения ксиланаз в составе кормовых рационов на основе злаков.

Были проведены исследования применения полученной КЖ Т. reesei М18.2 и коммерческого препарата — амилазы «Термамил» на гидролиз зерновых смесей. Компоненты смесей: ячмень (50%), рожь (40%), овёс (10%) (ЯРО) и ячмень (50%), пшеница (40%), овёс (10%) (ЯПО). Активности ксиланаз и целлюлаз, добавляемых в зерносмесь, соответствовали нормам кормовой промышленности и составили 0.025 мл на 25 г зерносмеси, а количество коммерческого препарата амилаз — 0.015 мл. Такая дозировка ферментов соответствует 0.5 МЕ ксила-наз/грамм зерна и 0.2 Ш амилаз/грамм зерна. Активности ферментов в исходном гидролизате составили 0.17 МЕ ксиланаз/мл и 0.07 МЕ амилаз/мл.

При применении ферментных препаратов в составе кормовых рационов особое значение имеет влияние температуры на активность ферментов. В процессе приготовления кормов часто применяется их предварительное прогревание или варка, имеющая целью частичный гидролиз кормовых компонентов и увеличение их переваримости. Гидролиз проводили при 60 °С (табл. 3).

КСИЛАНАЗЫ ТпсИоёегша гееяеI — БИОСИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ.

Табл. 3

Гидролиз зерновых смесей при 60 °С

Зерновая смесь (ячмень, пшеница, овёс) % гидролиза зерна Зерновая смесь (ячмень, рожь, овёс) % гидролиза зерна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Контроль: ЯПО без ферментов 15 ± 0.5 Контроль: ЯРО без ферментов 13 ± 0.7

ЯПО + ксиланаза, целлюлаза 21 ± 0.3 ЯРО + ксиланаза, целлюлаза 23 ± 0.1

ЯПО + амилаза 36 ± 0.5 ЯРО + амилаза 38 ± 0.5

ЯПО + ксиланаза, целлюлаза + амилаза 42 ± 0.2 ЯРО + ксиланаза, целлюлаза + амилаза 43 ± 0.4

Рис. 2. Хроматограмма растворимых моносахаров зерносмеси ЯПО до гидролиза

Хроматографическое исследование содержания растворимых моносахаров до и после гидролиза зерносмеси ЯПО показало незначительное количество ксилозы, арабинозы, глюкозы, сахарозы и мальтозы в растворе до начала гидролиза (рис. 2), что говорит о полимерном состоянии основных структурных углеводов зерна, мономерами которых являются моносахара.

После окончания гидролиза в результате работы ксиланаз, целлюлаз и амилаз повышалось содержание в растворе ксилозы, арабинозы, глюкозы и мальтозы, что говорит о гидролизе крахмала и ксилана зерна (рис. 3). Особенно значительно увеличилось содержание мальтозы и глюкозы в ферментолизате.

Основной объём гидролиза осуществляют амилазы. «Термамил» при 60 °С за 1 ч переводит в растворимое состояние 36-38% зерна. Добавка ксиланаз и целлюлаз в процессе позволяет увеличить гидролиз до 42-43% (табл. 3). Аналогичные результаты были показаны А.В. Марковым с соавторами : при гидролизе арабиноксилана комплексным ферментным препаратом, продуцируемым микроскопическим грибом Тпскоёегша longibrachiatuш, глубина процесса составляла 40%.

Рис. 3. Хроматограмма гидролизата зерносмеси ЯПО амилазами «Термамил» и ксила-назами Т. гвв^’в! М18.2

Заключение

Проведенные исследования показали, что штамм Тпскоёвгта reesei М18.2 способен к активному синтезу ксиланаз и целлюлаз на отходе спиртового производства — послеспиртовой барде. Результаты экспериментов на разных фракциях барды показали, что на осаждённой фракции происходил более активный синтез исследуемых ферментов. Показатели ксиланазной активности увеличивались на ней в среднем на 37%, а целлюлазной — на 40%. Это, вероятно, можно объяснить более доступными процессами диффузии растворенных веществ фильтрата барды в клетки продуцента, что обеспечивает его питательными веществами. Динамика исследования концентрации редуцирующих сахаров в процессе роста продуцента показала, что их количество уменьшается на протяжении всего процесса. Исследован состав полисахаридной фракции фуражного зерна РТ. Фуражные сорта ржи содержат до 11.4% этой фракции, именно это обстоятельство не позволяет использовать ее в качестве основы кормовых рационов сельскохозяйственных животных. Результаты работы показали проявление синергизма при совместном действии ксиланаз, целлюлаз и амилаз в процессе гидролиза изученных зерносмесей. Глубина гидролиза достигала 43%. Исследования доказали целесообразность применения ферментов Тпскоёегта reesei, полученных на послеспиртовой барде, для предварительного гидролиза зерновых кормов.

Литература

2. Алимова Ф.К. Современная система Trichoderma /Буроска // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. — 2005. — Т. 147, кн. 2. — С. 28-57.

КСИЛАНАЗЫ Trichoderma reesei — БИОСИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ.

8. Попов В.В. Рожь в питании животных // Адаптивное кормопроизводство. — 2012. -№ 1. — С. 15-23.

11. Ghose T.K. Measurement of cellulase activities // Pure & Appl. Chem. — 1987. — V. 59, No 2. — Р. 257-268.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Поступила в редакцию 13.02.13

Скворцов Евгений Владимирович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры биохимии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, Россия.

E-mail: eskvortsov@rambler.ru

Алимова Фарида Кашифовна — доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, Россия.

E-mail: farida_alimova@hotmail.com

* * *

Trichoderma reesei XYLANASES: BIOSYNTHESIS AND APPLICATION FOR HYDROLYSIS OF FEED GRAIN

Yu.A. Morozova, E.V. Skvortsov, F.K. Alimova Abstract

Keywords: Trichoderma reesei, xylanases, cellulases, amylases, enzymatic hydrolysis.

8. Popov V.V. Rye in animal nutrition. Adaptivnoe kormoproizvodstvo, 2012, no. 1, pp. 15-23. (In Russian)

KCHHAHA3M Trichoderma reesei — EH0CHHTE3 H nPHMEHEHHE.

11. Ghose T.K. Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem., 1987, vol. 59, no. 2, pp. 257-268.

15. Akberova N.I. Descriptive statistics. Interval Estimations. Kazan, Kazan. Gos. Univ., 2004. 40 p. (In Russian)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Received February 2, 2013